Cryo-EM dapat digunakan untuk menentukan struktur kompleks molekul besar seperti kompleks pengenalan asal (ORC).ORC mengenali dan mengikat DNA untuk memulai proses yang menyalin materi genetik sel sebelum pembelahan selKredit: Huilin Li, Brookhaven National Laboratory, dan Bruce Stillman, Cold Spring Harbor Laboratory.

Apa itu cryo-EM, dan bagaimana cara kerjanya?

Dalam cryo-EM, para peneliti dengan cepat membekukan sel, virus, kompleks molekul, atau struktur lainnya sehingga molekul air tidak punya waktu untuk membentuk kristal.Para ilmuwan menggunakan mikroskop elektron untuk meledakkan sampel beku dengan sinar elektronIni menciptakan proyeksi dua dimensi sampel pada detektor digital.Dengan membuat ratusan proyeksi sampel dari banyak sudut yang berbeda dan kemudian mengambil rata-rata sudut ini, para ilmuwan menghasilkan model tiga dimensi dari strukturnya. kemajuan terbaru dalam cryo-EM memberikan gambar yang sangat rinci dari protein dan struktur biologis lainnya,termasuk struktur yang lebih besar seperti kompleks RNA-protein.

Pengenalan Mikroskopi Elektron Kriogenik (Cryo-EM):

Selama dekade terakhir, mikroskop elektron kriogenik (cryo-EM) semakin menggantikan metode tradisional persiapan sampel untuk mikroskop elektron.Itu adalah karya perintis Taylor dan Glaeser dan Dubochet dan rekan-rekan yang membuka jalan bagi perkembangan ini, yang menyajikan lompatan kuantum mikroskop elektron biologis karena memungkinkan untuk mendapatkan gambar spesimen yang sepenuhnya terhidrasi dalam keadaan yang dekat dengan asli.

Istilah cryo-EM mengacu pada berbagai modalitas pencitraan transmisi mikroskopik elektron ketika diterapkan pada sampel yang tertanam dalam es vitreous.Tiga cabang utama dari cryo-EM relevan dalam konteks biologi struktur molekul: kristalografi elektron, analisis partikel tunggal dan tomografi elektron.

Kristallografi elektron menawarkan keuntungan dalam menentukan struktur protein yang membentuk kristal 2D di bawah 4Å (misalnya seperti yang ditunjukkan dengan protein membran pengangkut air - aquaporins).Protein membran adalah kandidat yang sangat menjanjikan untuk pembentukan kristal 2DResolusi lebih dari 2 Å telah diperoleh. three dimensional electron crystallography of protein microcrystals (microED) has been developed and is showing promises in solving high resolutions structures of proteins forming tiny 3D-crystals (200 nm) usually not amenable for study by x-ray crystallography.

Analisis partikel tunggal digunakan untuk pemasangan yang lebih besar terisolasi dan dimurnikan dari beberapa subunit yang sering sangat heterogen, metastabil dan sangat sulit untuk mengkristal (misalnyaribosom atau 26S proteasome) pada resolusi rutin 3 ‰ 10 Å dan dalam kasus terbaik di bawah 2 ÅKisaran ukuran sampel: 5-150 nm.

Apa itu kristalografi sinar-X, dan bagaimana cara kerjanya?

X-ray crystallography menembakkan sinar-X melalui kristal padat kecil yang terdiri dari triliunan molekul protein yang sama.mirip dengan cara gambar ditangkap dalam kamera digitalSebuah komputer mengukur intensitas sinar-X yang tersebar untuk menetapkan posisi untuk setiap atom dalam molekul kristalisasi. Hasilnya adalah gambar digital tiga dimensi.Metode ini telah digunakan untuk menentukan lebih dari 85 persen struktur protein yang diketahui.

Beberapa rincian tentang X-Ray Kristallography dan Cryo-EM:

1Protein kecil lebih cocok untuk kristalografi sinar-X karena mereka bisa sulit untuk membedakan dengan cryo-EM.

2Kristalografi sinar-X dapat memperoleh resolusi yang sangat tinggi, meskipun cryo-EM telah memiliki hasil yang sebanding dalam beberapa tahun terakhir.

3Struktur besar, kompleks, dan protein membran bisa sulit untuk mengkristal.

4EM (negative stain) menawarkan skrining cepat sampel untuk mengesampingkan agregasi dan menentukan oligomerization, memberikan gambaran visual tentang bagaimana perilaku sampel dan apa yang terkandung di dalamnya.

5Cryo-EM membutuhkan jumlah protein yang lebih rendah daripada kristalografi sinar-X. Metode ini mungkin bermanfaat untuk sampel dengan hasil kurang dari 2 mg protein (<5-10 mg/ml).*

KS-V Peptide Cryo-EMPlatform Layanan:

• Penyaringan pewarnaan negatif dan perhitungan klasifikasi 2D
• Persiapan sampel kisi beku dan skrining kondisi
• Pengumpulan data resolusi tinggi dan rekonstruksi 3D, pemodelan