Bersama-sama, modifikasi histon ini membentuk apa yang dikenal sebagai kode histon, yang menentukan keadaan transkripsi wilayah genom lokal.Memeriksa modifikasi histon di daerah tertentu, atau di seluruh genom, dapat mengungkapkan keadaan aktivasi gen, lokasi promotor, penambah, dan elemen regulator gen lainnya.

Modifikasi histone secara rinci
 

Asetilasi

Asetilasi adalah salah satu modifikasi histon yang paling banyak dipelajari karena merupakan salah satu yang pertama ditemukan mempengaruhi regulasi transkripsi.Sisa lisin yang tidak dimodifikasi bermuatan positif tetapi asetilasi menghasilkan netralisasi muatan pada histon, yang mengurangi interaksi histon dan DNA bermuatan negatif. netralisasi muatan menghasilkan histon lemah: interaksi DNA,memungkinkan pengikatan faktor transkripsi dan secara signifikan meningkatkan ekspresi gen (Roth et al.., 2001).

Histone acetylation terlibat dalam regulasi siklus sel, proliferasi sel, dan apoptosis dan dapat memainkan peran penting dalam mengatur banyak proses seluler lainnya, termasuk diferensiasi seluler,Replikasi dan perbaikan DNAKetidakseimbangan dalam keseimbangan asetilasi histon dikaitkan dengan tumorogenesis dan perkembangan kanker.

Regulasi enzim

Kelompok asetil ditambahkan ke residu lisin histon H3 dan H4 oleh histon asetiltransferase (HAT) dan dihapus oleh deacetylases (HDAC).dikenal sebagai promotor-lokalisasi asetilasiMisalnya, asetilasi K9 dan K27 pada histon H3 (H3K9ac dan H3K27ac) biasanya dikaitkan dengan penambah dan promotor gen aktif.Tingkat asetilasi global yang rendah juga ditemukan di seluruh gen yang ditranskripsikan, yang fungsinya masih belum jelas.

Metilasi

Metilasi ditambahkan ke residu lisin atau arginin dari histon H3 dan H4, dengan dampak yang berbeda pada transkripsi.et al., 2012) sementara metilasi lisin terlibat dalam aktivasi transkripsi dan represi tergantung pada situs metilasi.Fleksibilitas ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa metilasi tidak mengubah muatan histon atau secara langsung mempengaruhi interaksi histon-DNA., tidak seperti asetilasi.

Lisin dapat mono-, di-, atau tri-metilasi, memberikan keragaman fungsional lebih lanjut ke setiap situs metilasi.baik mono- dan tri-metilasi pada K4 histon H3 (H3K4me1 dan H3K4me3) adalah penanda aktivasi, tetapi dengan nuansa yang unik: H3K4me1 biasanya menandai penambah transkripsi, sementara H3K4me3 menandai promotor gen.tri-metilasi K36 (H3K36me3) adalah penanda aktivasi yang terkait dengan wilayah yang ditranskripsikan dalam tubuh gen.

Sebaliknya, tri-metilasi pada K9 dan K27 histon H3 (H3K9me3 dan H3K27me3) adalah sinyal represif dengan fungsi unik:H3K27me3 adalah sinyal sementara di daerah promotor yang mengontrol regulator perkembangan dalam sel induk embrionikSementara itu, H3K9me3 adalah sinyal permanen untuk pembentukan heterochromatin di wilayah kromosom miskin gen dengan struktur pengulangan tandem, seperti pengulangan satelit,Telomer, dan pericentromeres. Ini juga menandai retrotransposon dan keluarga spesifik gen jari seng (KRAB-ZFPs).dengan H3K27me3 di wilayah pengkodean intergenik dan diam dan H3K9me3 terutama di wilayah pengkodean gen aktif.

Regulasi enzim

Metilasi histon adalah tanda stabil yang menyebar melalui beberapa pembelahan sel, dan selama bertahun-tahun dianggap tidak dapat diubah.baru-baru ini ditemukan bahwa itu adalah proses yang diatur secara aktif dan reversibel.

Metilasi: histone methyltransferases (HMTs)

• Lisin

Berisi domain SET (kijang histone)

Berisi domain non-SET (inti histone)

• Arginine

Keluarga PRMT (protein arginin metiltransferase)

Demethylation: histone demethylases

• Lisin

KDM1/LSD1 (lysine-specific demethylase 1)

JmjC (Jumonji domain-mengandung)

• Arginine

PAD4/PADI4

Fosforilasi

Fosforilasi histon adalah langkah tengah penting dalam kondensasi kromosom selama pembelahan sel, regulasi transkripsi, dan perbaikan kerusakan DNA (Rossetto et al., 2012, Kschonsak et al.,2015)Berbeda dengan asetilasi dan metilasi, fosforilasi histon membentuk interaksi antara modifikasi histon lainnya dan berfungsi sebagai platform untuk protein efektor,yang mengarah ke kaskade acara hilir.

Fosforilasi terjadi pada semua histon inti, dengan efek diferensial pada masing-masing. Fosforilasi histon H3 pada serin 10 dan 28, dan histon H2A pada T120,terlibat dalam kompaksi kromatina dan regulasi struktur dan fungsi kromatina selama mitosisIni adalah penanda penting dari siklus sel dan pertumbuhan sel yang dilestarikan di seluruh eukariota.Fosforilasi H2AX pada S139 (menghasilkan γH2AX) berfungsi sebagai titik perekrutan untuk protein perbaikan kerusakan DNA (Lowndes et al.., 2005, Pinto et al., 2010) dan merupakan salah satu peristiwa paling awal yang terjadi setelah DNA double-strand break.Fosforilasi H2B tidak begitu baik studi tetapi ditemukan untuk memfasilitasi apoptosis terkait kromatina kondensasi, fragmentasi DNA, dan kematian sel (Füllgrabe et al., 2010).

Ubiquitylation

Semua protein inti histon dapat ubiquitylated, tetapi H2A dan H2B paling umum dan adalah dua dari protein yang paling ubiquitylated di inti (Cao et al., 2012).Ubiquitylation histone berperan penting dalam respon kerusakan DNA.

Monoubiquitylation histon H2A, H2B, dan H2AX ditemukan di situs DNA double-strand break. bentuk yang paling umum adalah monoubiquitylated H2A pada K119 dan H2B pada K123 ( ragi) / K120 (vertebrata).Monoubiquitylated H2A juga terkait dengan gen silencing, sedangkan H2B juga terkait dengan aktivasi transkripsi.

Polyubiquitylation kurang umum tetapi juga penting dalam perbaikan DNA-- polyubiquitylation dari H2A dan H2AX pada K63 menyediakan situs pengenalan untuk protein perbaikan DNA, seperti RAP80.

Regulasi enzim

Seperti modifikasi histon lainnya, monoubiquitylation dari H2A dan H2B dapat dibalikkan dan diatur ketat oleh ligase histon ubiquitin dan enzim deubiquitylating.

Monoubiquitylation

• H2A: protein kelompok polikomb
• H2B: Bre1 ( ragi) dan homolognya RNF20/RNF40 (sampul)

Polyubiquitylation

• H2A/H2AX K63: RNF8/RNF168
   

Panduan referensi cepat untuk modifikasi histon

Tabel 1. lembar cheat untuk modifikasi histone yang paling umum dandi mana untuk menemukan mereka:

Mempelajari modifikasi histon dengan ChIP

ChIP menggunakan antibodi untuk mengisolasi protein atau modifikasi yang menarik, bersama dengan DNA yang mengikatnya (gambar 5).DNA kemudian diurutkan dan dipetakan ke genom untuk mengidentifikasi protein atau modifikasi lokasi dan kelimpahan.

Gambar 2: Modifikasi histon CHIP

Antibodi mengikat langsung pada ekor histon yang dimodifikasi. Imunopresipitasi dan pemurnian DNA memungkinkan isolasi dan identifikasi wilayah genom yang diduduki modifikasi.

Menggunakan antibodi terhadap histon tertentu dan modifikasi histon dalam eksperimen ChIP dapat mengungkapkan lokasi spesifik dari

• Struktur kromatina orde yang lebih tinggi, misalnya tanda H3K9me3 heterochromatin dan pengulangan satelit
• Gen aktif atau diam dan program genetik, misalnya AH3K9ac menandai aktivasi gen
• Elemen genetik seperti promotor dan penguat, misalnya H3K27me3 menandai promotor di daerah kaya gen, H3K4me1 menandai penguat aktif

Jika fungsi modifikasi histon diketahui, ChIP dapat mengidentifikasi gen dan wilayah tertentu dengan tanda tangan modifikasi histon ini dan fungsi yang sesuai di seluruh genom.Gen dan daerah ini kemudian dapat diperiksa lebih lanjut untuk peran mereka dalam proses biologis yang menarikMenggunakan ChIP terhadap H3K4me1, misalnya, akan mengungkapkan lokasi dan urutan penambah aktif di seluruh genom, menunjuk gen dan program genetik yang menarik.

Sebagai alternatif, jika fungsi modifikasi histon tidak diketahui, ChIP dapat mengidentifikasi urutan, gen, dan lokasi dengan tanda tangan ini,yang kemudian dapat digunakan untuk menyimpulkan fungsi dari modifikasiTeknik ini sangat penting dalam mendekode banyak kode histon dan masih berharga dalam memastikan fungsi modifikasi yang baru ditemukan seperti ubiquitylation dan penanda baru lainnya.

Enzim modifikasi histon: penulis dan penghapus
Aku tidak tahu.

Modifikasi histon secara dinamis ditambahkan dan dihilangkan dari protein histon oleh enzim khusus (tabel 2). Keseimbangan antara penulis dan penghapus ini menentukan tanda mana yang ada pada histon,dan pada tingkat apa, untuk akhirnya mengontrol apakah program genetik tertentu dan proses seluler yang mereka mengatur, diaktifkan atau dimatikan.

Tabel 2. Kategori utama histone writer dan eraser:

Mengidentifikasi jalur modifikasi dan penulis khusus dan penghapus yang bermain dapat mengungkapkan:

• Jalur sel yang relevan, program genetik dan efek fisiologis untuk penyelidikan lebih lanjut.Misalnya, histone deacetylases (HDAC) mengaktifkan jalur perkembangan kekebalan tubuh, sementara histone acetyltransferases (HAT) memainkan peran penting dalam diferensiasi dan proliferasi.
• Ketidakseimbangan antara penulis dan penghapus yang mengubah pemrograman genetik dan mendasari proses penyakit.Menciri ketidakseimbangan tersebut, dan enzim spesifik yang terlibat, dapat memberikan wawasan tentang patologi penyakit, dari kanker hingga gangguan autoimun.
• Target obat baru dan strategi terapi.Setelah ketidakseimbangan diidentifikasi, obat dapat dikembangkan untuk mempengaruhi aktivitas enzim ini dan memperbaiki ketidakseimbangan,menawarkan strategi terapi baru terhadap penyakit yang sejauh ini menghindari upaya medisSebagai contoh, banyak inhibitor HDAC sedang dikembangkan sebagai obat baru terhadap kanker dan penyakit peradangan seperti arthritis dan diabetes tipe I.

Untuk upaya pengembangan obat, senyawa dapat dengan mudah disaring untuk dampaknya pada aktivitas penulis dan penghapus.

Karakterisasi jalur metilasi histon

Secara umum, tes histon metiltransferase (HMT) sulit dikembangkan, dan sebagian besar memiliki beberapa kelemahan karena desain tes.3H-SAM sebagai donor metil dan mengukur S-adenosilhomocysteine (SAH) sebagai produk sampingan umum dari reaksi metilasi.

• Penanganan bahan radioaktif
• Sensitivitas tinggi untuk mengatasi k rendah_kucing(putaran biasanya < 1 min-1) dan K_Mnilai untuk donor metil, SAM
• Pemurnian awal kompleks enzim/protein untuk menilai aktivitas HMT tertentu

Analisis aktivitas HMT Abcam mengatasi kesulitan ini, menilai aktivitas HMT tertentu dengan antibodi yang mendeteksi produk metilasi tertentu, memberikan:

• Deteksi colorimetric atau fluorometric yang mudah, tanpa radioaktivitas
• Kompatibilitas dengan ekstrak nuklir, atau protein yang dimurnikan (pengujian khusus untuk modifikasi yang relevan)
• Data dalam 3 jam

Karakterisasi aktivitas demetilase

Analisis aktivitas histone demethylase biasanya mengukur pembentukan formaldehida, produk sampingan dari demethylation.kelompok tiol dan rentang ionMirip dengan tes metilasi, tes ini tidak spesifik untuk demethylase dan hanya dapat dilakukan dengan protein yang dimurnikan.

Abcam's histone demethylase assays menghindari masalah ini dengan secara langsung mengukur pembentukan produk demethylated, memberikan:

• Peningkatan sensitivitas (20-1.000 kali lipat) dibandingkan dengan tes berbasis formaldehida
• Data yang lebih akurat tanpa gangguan dari tiol, deterjen atau ion
• Kompatibilitas dengan ekstrak nuklir atau protein murni (karena spesifisitas tes untuk modifikasi yang menarik)
• Mengukur aktivitas demetilase dari berbagai spesies termasuk sel/jaringan mamalia, tumbuhan, dan bakteri
• Format microplate cepat dengan pembacaan colorimetric atau fluorometric sederhana
• Data dalam 3 jam

Karakterisasi jalur asetilasi histon

Abcam menawarkan kit untuk menganalisis aktivitas HAT secara keseluruhan, serta H4-spesifik.yang menghasilkan peptida asetilasi dan CoA-SHProduk sampingan CoA-SH kemudian diukur dengan metode kolorimetrik atau fluorometrik:

• Tes kolorimetris- CoA-SH berfungsi sebagai koenzim penting untuk memproduksi NADH, yang bereaksi dengan pewarna tetrazolium larut untuk menghasilkan produk yang dapat dideteksi secara spektrophotometric.Tes ini ideal untuk studi kinetik, dengan deteksi terus menerus.
• Tes fluorometrik- CoA-SH bereaksi dengan pengembang dan probe untuk menghasilkan produk yang terdeteksi fluorometrically.

Karakterisasi aktivitas histone deacetylase

Protein HDAC terbagi menjadi empat kelompok utama (kelas I, kelas IIA, kelas IIB, kelas III, kelas IV) berdasarkan fungsi dan persamaan urutan DNA.dan IIB dianggap sebagai HDAC "klasik" yang aktivitasnya terhambat oleh trichostatin A (TSA), sedangkan kelas III adalah keluarga NAD+Kelas IV dianggap sebagai kelas atipikal sendiri, berdasarkan kesamaan urutan DNA dengan yang lain.

Masing-masing kelas ini terkait dengan program sel yang berbeda dan dapat diuji secara individual dengan berbagai uji fluorometrik.SIRT biasanya dikaitkan dengan kanker dan penyakit neurologisMenyadari aktivitas SIRT, atau mengidentifikasi obat-obatan yang mempengaruhi aktivitas SIRT, dapat menunjukkan strategi diagnostik atau terapi baru untuk penyakit ini.

Tes fluorometrik menggunakan substrat peptida asetilasi dengan fluorophore dan quencher di terminal amino dan karboksilnya.melepaskan fluorophore dari pemadamPeningkatan intensitas fluoresensi dari fluorophore secara langsung proporsional dengan aktivitas deacetylase.

Mencegah penulis dan penghapus

Hal ini dapat berguna untuk menghambat enzim modifikasi ini menggunakan molekul kecil dan kemudian menilai konsekuensi hilir untuk menyelidiki keterlibatan dan fungsi biologis dari modifikasi histon.penghambat penulis dan penghapus adalah alat penting untuk memahami peran jalur modifikasi epigenetikMereka juga sangat penting untuk validasi target yang "berguna" dalam konteks studi pra-klinis baik dalam konteks akademis maupun industri.

Pembaca/penerjemah modifikasi histone

Modifikasi histon mengatur sifat fisik kromatina, dan transkripsi yang sesuai,baik secara langsung (misalnya kelompok asetil yang menolak DNA bermuatan negatif untuk menciptakan konformasi kromatina terbuka) atau melalui adaptor protein yang disebut efektorEfektor protein mengenali dan mengikat pada tanda epigenetik tertentu, dan kemudian, merekrut mesin molekuler untuk mengubah struktur kromatina.Pembaca epigenetik ini menentukan hasil fungsional dari modifikasi histon dengan menerjemahkan kode histon ke dalam tindakan.

Domain efektor mengenali modifikasi histon tertentu

Protein efektor mengenali dan mengikat pada tanda modifikasi histon melalui domain efektor, yang dikenal sebagai modul (Tabel 3).

Modul ini mengenali modifikasi histon tertentu dengan asam amino yang melapisi kantong pengikat modul.residu di luar kantong pengikat ini (terutama di posisi N+2 dan N-2) menentukan spesifisitas untuk histon dan residu asam amino yang dimodifikasi (misalnya H3K4 vs H4K20).

Perbedaan kecil residu di dalam atau di luar kantong pengikat memungkinkan pengenalan tanda epigenetik yang sama.atau keadaan tri-metilasi dengan sedikit variasi pada struktur modul pengikatan metilSebagai contoh, domain tudor dapat mengikat secara eksklusif dengan lisin di- atau tri-metilasi, sedangkan modul jari PHD dapat mengikat keduanya, atau hanya dengan lisin yang tidak dimodifikasi (Ruthenburg et al., 2007).

Multivalensi memungkinkan kompleksitas kode histon

Beberapa modul pengikat histon sering ditemukan dalam protein yang sama, dan/atau kompleks protein, yang memungkinkan pengenalan kombinasi spesifik modifikasi histon.Hal ini memungkinkan untuk kode histone yang lebih kompleks, di mana modifikasi histon berinteraksi satu sama lain daripada ditafsirkan secara terpisah.

Keterlibatan multivalent dari modifikasi histon penting untuk mengenali pola penandaan diskrit dengan spesifisitas komposit dan afinitas yang ditingkatkan,sementara juga memungkinkan tindakan turun-temurun yang beragam dan tepatMisalnya, satu tanda epigenetik (seperti H3K4me3) dapat mengaktifkan transkripsi gen dalam satu konteks, tetapi menekannya di konteks lain, tergantung pada tanda sekitarnya.Tabel 4 menunjukkan contoh beberapa asosiasi fungsional dari kombinasi yang berbeda dari modifikasi histon (Ruthenburg et al.., 2007).

Tabel 4. Asosiasi fungsional dari modifikasi histon dan DNA yang ada bersama:

Beberapa modul efektor dalam protein atau kompleks dapat berinteraksi dengan modifikasi histon pada histon dan/atau nukleosom yang sama, atau di seluruhnya.

Intranucleosomal:Mengikat pada nukleosom yang sama

• Cis-histone: mengikat pada ekor histone yang sama
• Trans-histone: mengikat pada ekor histone yang berbeda

Internukleosomal:mengikat nukleosom yang berbeda

• Jembatan berdekatan: mengikat nukleosom berdekatan
• Jembatan diskontinu: mengikat nukleosom yang tidak berdekatan

Referensi

Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., dan Zhao, K. Profil resolusi tinggi metilasi histon dalam genom manusia. Sel 129,823-837 (2007).

Cao, J. & Yan, Q. Histone ubiquitination dan deubiquitination dalam transkripsi, respon kerusakan DNA, dan kanker.

Füllgrabe, J., Hajji, N. & Joseph, B. Meretas kode kematian: modifikasi histon terkait apoptosis.

Greer, E. L. & Shi, Y. Metilasi histon: tanda dinamis dalam kesehatan, penyakit dan warisan.

Kim, J. & Kim, H. Rekrutmen dan konsekuensi biologis dari modifikasi histon H3K27me3 dan H3K9me3. ILAR J. 53 (((3-4):232-9 (2012).

Kschonsak, M. & Haering, C. H. Membentuk kromosom mitosis: Dari konsep klasik ke mekanisme molekuler.

Lowndes, N. F. & Toh, G. W.-L. Perbaikan DNA: pentingnya fosforilasi histon H2AX.

Pinto, D. M. S. & Flaus, A. Struktur dan fungsi histon H2AX. Subsel. Biokimia.

Rossetto, D., Avvakumov, N. & Côté, J. Fosforilasi histon: Modifikasi kromatina yang terlibat dalam berbagai peristiwa nuklir.

Roth, S. Y., Denu, J. M. & Allis, C. D. Histone acetyltransferases.

Ruthenburg, A.J., Li, H., Taverna, S.D., Patel, D.J. & Allis, C.D. Keterlibatan multivalent dari modifikasi kromatina oleh modul pengikat yang terkait.

Voigt, P., Tee, W.W., dan Reinberg, D. Sebuah duplikat mengambil promotor bivalen.